盡管絕大多數成像實驗測量的是熒光的強度，但FLIM利用了熒光的另一個關鍵特性，為研究增添了豐富的信息來源——即熒光壽命。一種熒光染料具有特征發射光譜，同時也具有熒光壽命，后者反映了染料處于激發態的時間長短。FLIM圖像的對比度取決于熒光信號的壽命，而非其強度。由于熒光壽命依賴于染料所處的微環境，因此這一信息能為實驗提供一些有價值的全新見解。

直到最近，壽命成像仍被認為對于日常顯微應用（尤其是涉及活細胞成像的應用）而言過于緩慢、復雜且昂貴。但這一切正在迅速改變。借助當今的先進技術，壽命成像正變得比以往任何時候都更快捷、更易于使用。

熒光壽命信息與熒光探針濃度無關，因此FLIM在研究分子功能、相互作用和環境方面，對于功能成像具有重要價值。FLIM還可結合生物傳感器用于細胞微環境的研究。此外，FLIM可用于區分發射光譜重疊的熒光探針，并消除不必要的背景信號。

在本頁面上，您將找到一份關于您可能對FLIM提出的各種問題的指南，并附有相關文章鏈接供進一步閱讀。了解更多有關FLIM基礎知識的信息。

FLIM可提供僅有強度數據通常無法提供的信息。熒光壽命信息可幫助生命科學研究人員區分標本中的不同熒光團，即使它們的發射光譜相互重疊。與強度不同，熒光壽命與分子濃度無關，但它取決于染料的微環境，因此FLIM可以監測標本內局部環境條件的動態變化。

FLIM可以幫助您獲得新見解的一些常用應用包括：

事實證明，FLIM與佛斯特共振能量轉移（FRET）相結合的生物醫學研究應用也有利于研究細胞的動態變化。FRET可以監測配體與受體、蛋白質或效應物與DNA之間的分子相互作用。

最近利用熒光顯微成像技術進行的糖尿病研究，研究了胰島中的α細胞和β細胞功能障礙導致的正常血糖水平維持缺陷。多光子相位-FLIMNADH自發熒光成像技術用于檢測葡萄糖刺激前后活體胰島細胞的新陳代謝變化。在健康胰島細胞中，葡萄糖刺激后相位熒光成像可觀察到β細胞的氧化磷酸化增加和α細胞的氧化磷酸化抑制，但在2型糖尿病胰島細胞中卻觀察不到這些變化。

FLIM可以通過多種方法為您當前的共聚焦實驗增加深度，包括減少圖像中出現偽影的幾率、區分真實信號和不需要的自發熒光，以及有把握地區分更多熒光團。

熒光是分子或原子在吸收光后被激發而自發發射光子的過程。如果兩個熒光分子（熒光染料）彼此非常接近，僅相隔數個納米，能量可直接從“供體"傳遞至“受體"熒光染料，而不會發生光的發射。這種直接的能量傳遞被稱為弗斯特共振能量轉移（FRET）。

FRET的發生可通過多種現象體現。首先，樣品（受體）將發出一種無法由所用激發光顏色預期的熒光信號。該發射信號可被檢測并與原始發射進行比較，此方法稱為“敏化發射"。敏化發射可定量地反映FRET的發生。

另一方面，由于部分激發態會轉移至受體，供體的發射信號將減弱。這一現象被應用于一種稱為“受體光漂白"的方法中，即通過光漂白消除受體后測量供體發射信號的變化。當受體被去除后，供體的發射信號將增強。

熒光染料發射光譜的重疊程度越高，FRET發生的概率越大。分子的取向也會影響能量轉移。FRET可用于檢測和研究細胞內分子間的相互作用，例如配體與受體、蛋白質之間，或效應分子與核酸之間的相互作用。

基于強度的FRET方法對樣品中熒光染料含量的變化、分子擴散、樣品位移以及激發光波動等因素較為敏感。幸運的是，FLIM與FRET的結合在克服上述限制方面具有顯著優勢。當發生FRET時，供體的熒光壽命會出現明顯縮短，甚至可作為FRET效率的衡量指標。更多信息結合FLIM和FRET。

徠卡顯微系統公司的STELLARIS 8 FALCON為生物傳感及蛋白質間相互作用的追蹤打開了大門，現在所有成像模式均可提供FLIM信息。這一創新性集成系統使研究人員能夠通過FLIM-FRET跟蹤快速分子相互作用，利用生物傳感器檢測代謝狀態和微環境的變化，并應用壽命對比技術分離多種熒光探針。此外，STELLARIS 8 FALCON解決方案使研究人員能夠在極少培訓的情況下獲取FLIM數據。

該解決方案通過熒光壽命提供了新的圖像對比度維度，從而實現生物傳感，并借助FLIM-FRET監測即使是非?？焖俚姆肿酉嗷プ饔?。它還使研究人員能夠利用生物傳感器檢測代謝狀態和細胞環境的變化，并通過壽命信息區分不同的熒光探針。

采用FLIM相量分析可對壽命組分進行二維可視化。相量分析方法無需任何擬合過程。FLIM相量的圖形化顯示使觀察者能夠快速區分并分離不同的壽命組分，且分布解讀直觀明確。單個像素內即可分辨多種分子樣本，因每種樣本均具有特定的相量。FLIM相量可用來追蹤細胞環境的變化、選擇用于信號多標的組分，并測定FRET效率。

在活體三維癌癥患者器官組織上進行FLIM。利用ERK FRET-FLIM生物傳感器監測活體器官中癌癥衍生信號轉導活性的增加。

利用STELLARIS 8 FALCON系統的快速電子器件和靈敏的光譜混合探測器，可以實現逐像素量化的視頻速率FLIM。光子到達時間以標準共焦成像的典型計數率記錄。該系統具有超短的死區時間和內置算法，可用于數據采集和分析。傳統的時間相關單光子計數（TCSPC）解決方案本身速度慢且難以實施，因此FLIM成像僅限于專家使用，無法提供研究生物過程所需的速度，研究速度無法超過數十秒。

為了獲得快速結果，壽命成像已無縫集成到STELLARIS 8 FALCON平臺的全光譜靈活共焦成像和處理工具中。壽命信息作為典型共焦圖像的額外對比通道進行記錄。因此，現在記錄FLIM數據就像按下按鈕一樣簡單。

STELLARIS獨特的TauSense技術使您能夠從每個樣本中提取額外的信息，提高研究的科學影響力。TauSense由基于熒光壽命的應用導向型成像工具組成，您可以利用它來探索分子在細胞環境中的功能：

有關Tausense的更多詳情，請參閱我們在《Nature Methods》上發表的應用說明。

用近紅外膜染色劑標記的哺乳動物細胞中的囊泡運輸，每1.82秒拍攝1幅圖像：早期內體：青色/黃色。晚期內體和溶酶體：品紅色/紅色。

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