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情景導入
在樹脂塊中定位特定細胞或結構，是超薄切片技術中最持久的挑戰之一。傳統的光學輔助工具（體視顯微鏡、干涉色和明場成像）有助于確定塊面方向和評估切片厚度。不過，它們仍然無法確定熒光標記感興趣區域的確切位置。
通過在嵌入樹脂后，保留樣品內的熒光信號，從而可直接觀察到區塊內的目標結構。
這一功能將修塊從一個不確定的過程，轉變為一個有指導的工作流程，確保有效地暴露感興趣的區域，并將損失降低。
Leica UC Enuity將熒光成像，與體視顯微鏡和明視野顯微鏡，以及自動修塊程序集成在一起。這種組合使用戶能夠實時觀察標記的細胞，同時控制切片參數。通過使光學圖像與熒光信號相一致，UC Enuity能夠精確導航到嵌入目標并減少樣品浪費。
本章以9月24號推文內容為基礎。在這里，重點從制備均勻的切片，轉移到使用熒光作為導航工具。這些技術對于CLEM等關聯工作流程尤為重要。因為在這些流程中，熒光和EM數據之間的精確對應至關重要。在下一篇中，我們將看到顯微CT如何從另一個維度，將定位能力從光學信號，擴展到體積成像數據。
嵌入Lowicryl® HM20的秀麗隱桿線蟲；咽部顯示紅色熒光（mCherry）。圖中顯示的是，EM AFS2流動腔底部形成的樹脂膠囊的正視圖。
膠囊是經過人工預修剪的。隨后，利用UC Enuity的自動修塊功能AutoTrim，在蠕蟲熒光的引導下自動修整塊面。兩個正方形相對于圖像的邊長均為250 µm。
標準配置
使用標準方法制備vEM樣品時，重金屬和環氧樹脂的濃度 會影響熒光信號，使這種方法有時候不太適合，或不適合光學顯微鏡的方案。
為克服這一問題，我們設計了一種方法，以在樣品制備過程中，保存熒光信號，以定位標記結構。
樣品固定
制備電子顯微鏡（EM）標本的首要任務是固定樣本。
在本文重點介紹的方案中，使用物理低溫固定技術，來替代傳統的化學固定技術。在這種方法中，樣品幾乎在瞬間被高 壓冷凍（HPF），防止冰晶形成，并使水保持玻璃狀（玻璃化）。這被認為是一種盡可能接近自然的狀態。對于細胞層，可使用投入式冷凍裝置（如Leica EM GP2）進行低溫固定，但對于顆粒和深度達200微米的較厚樣品，則要進行HPF（如使用EM ICE)。
冷凍替代和染色
然后，在低于或接近-90°C的溶劑中對樣本進行脫水（冷凍替代，FS），以保存超微結構。化學固定相比，冷凍替代被認為能提供更好的保存效果。一般來說，對于樹脂內熒光，丙酮優于乙醇用于脫水，但為了避免熒光損失，暴露時間要短。
由于有機材料和包埋樹脂的電子密度較低，因此在FS過程中會加入重金屬化合物，如醋酸鈾酰（UA）和，它們對蛋白質和脂質具有特殊的親和力。
由于會影響熒光，因此在下面的凍存替代過程中使用了低濃度的UA。
滲透和包埋
替代水之后，使用溶劑稀釋樹脂，以促進樣品在固化前的滲透。為了保持熒光信號，并避免固化溫度過高，Lowicryl® HM20或LR White等丙烯酸樹脂是選擇。此外，丙烯酸樹脂可在低溫（約-20°C）下使用，有助于保持樣品結構的完整性。
示例方案1-細胞樣本
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低溫固定
對于HPF，細胞通常生長在藍寶石圓盤上（因為玻璃會被HPF破壞），或以懸浮液的形式直接置于樣品架上。標準裝配方法和HPF方案可從不同制造商處獲得（如EM ICE）為防止細胞外冰晶的形成，并提高冷凍質量，可使用冷凍保護劑。在組裝用于高壓冷凍的樣品載具時，通常會使用非滲透性液體，如右旋糖酐（15-20%）、Ficoll®（5-20%）或未稀釋的1-十六碳烯。
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冷凍替代和染色
如上所述，冷凍置換使用的是溶于丙酮中0.1%的低濃度醋酸鈾，根據細胞類型和UA儲存來源的不同，有些方案甚至將UA濃度降至0.04%。雖然有些方案建議在-90°C下，初始孵育72小時，但細胞樣本也可使用較短的孵育時間，以加快這一漫長的過程（圖1）。為了最大限度地減少長時間操作過程中的人工操作，最好使用帶液體處理功能的自動冷凍替代系統。徠卡開發了這樣一種設備，即自動冷凍置換系統EMA FS2，它配備了一個液體處理裝置，即冷凍置換處理器EM FSP。
如圖1所示，細胞樣本在0.1%的醋酸鈾和無水丙酮中保存9小時，溫度為-90°C。之后溫度逐漸升至-45°C，并在此溫度下保持5小時，以便UA對樣品進行染色（具體時間取決于樣品）。然后，通過三組丙酮清洗步驟，去除乙酸鈾酰，完成冷凍置換和染色步驟。
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滲透和聚合
然后，開始用濃度不斷增加的Lowicryl® HM20樹脂浸潤，浸潤過程持續2小時，同時將溫度升至-25°C。溫度保持在-20°C以下，這是為了保持樣本的完整性，并利用樹脂的低粘度進行有效浸潤，避免蛋白質破壞。在三個樹脂交換周期，以及隨后48小時的主要紫外線聚合過程中，溫度都保持在-25°C。在此過程中，EM AFS2上的液體處理裝置，被自動紫外線燈取代。
在最后的9小時固化過程中，紫外線聚合作用繼續進行，同時溫度升至20°C，在此溫度下可對樣品進行后續修剪和切片處理（例如，請參閱本節熒光微調應用說明）。
圖1：用于EM AFS2的冷凍替代方案1，適用于較小的細胞樣本。
實例方案2-類器官與胚胎樣本制備
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低溫固定
要冷凍固定器官組織、組織塊或果蠅等等比細胞大的模型生物樣本，HPF是方法，但樣品厚度極限約為200微米。
由于HPF期間應避免不必要的/非樣品空間，因此可選用不同容積的樣品架適配樣品。由于細胞外空間比細胞大得多，因此形成破壞性冰晶的風險要高得多。因此，冷凍保護劑的使用更為頻繁。
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冷凍替代和染色
為了保持熒光，還在無水丙酮中加入低濃度的0.1%醋酸鈾酰進行冷凍置換。有時會在胚胎或卵室上穿孔，以改善浸潤。
從圖2可以看出，替代階段比細胞長得多，即72小時，之后以3°C/小時的速率升溫。隨后，樣品在-45°C下再放置5小時，以確保適當染色效果。這是進行染色的關鍵步驟，因樣本而異。Ronchi等人認為，這對他們使用的樣本（如果蠅卵巢和幼蟲、乳腺器官）來說是選擇。
圖2：用于類器官、組織、果蠅組織或小胚胎的EM AFS2冷凍替代方案2。
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滲透和聚合
在用無水丙酮進行三輪清洗后，使用Lowicryl® HM20浸潤樣本，在四個6小時的時間浸潤階段內，樹脂濃度不斷增加。在第三和第四個樹脂浸潤階段中，溫度升至-25°C，以進一步提高滲透率。溫度保持-20°C以下，以保持樣本的完整性，并利用樹脂的低粘度進行有效滲透，避免蛋白質破壞。在交換和再填充的三個循環過程中，溫度保持在-25°C，隨后進行48小時的紫外線聚合。在此過程中，EM AFS2上的液體處理裝置被紫外線燈取代。在最后升溫至20°C的過程中，確保樹脂硬化并穩定標本，以便進行后續的超薄切片步驟（例如，請參閱本應用說明熒光切片應用說明）。
為了利用熒光，對塊面進行靶標修塊，并進行包埋后 CLEM實驗（圖中未顯示），我們對上述方案進行了調整，使其適用于在基因上表達咽部和腸道標記的線蟲（圖3）。手動預先修整流通池。
舉例：
圖3：熒光標記的秀麗隱桿線蟲包埋于Lowicryl® HM20樹脂。左圖：從EM AFS2流動室取出的聚合塊俯視圖。正方形表示蠕蟲前咽的紅色熒光信號。比例尺：200 µm。中心：方形區域特寫雙通道圖像，綠色顯示腸細胞的內質網，紅色顯示前咽。比例尺：100 µm。右圖：自動修塊后，包含目標蠕蟲的區塊面的俯視圖。樹脂塊右側是圓形的，這主要是由于通流室的邊緣。比例尺：100 µm。
隨后，在UC Enuity上設置修塊區域，以創建包含目標蠕蟲的塊面，并自動執行修塊，之后無需用戶再進行調整。
詳細的熒光自動修塊方案如下：
初始替代時間為48小時，隨后是13小時的升溫至-45°C。隨著HM20濃度的增加，遞增時間為4小時。這些步驟調整到介于上述方案持續時間之間。這與樣品的經驗、尺寸、表皮厚度和滲透性的經驗是一致的。
圖4：用于秀麗隱桿線蟲的冷凍替代方案。
總結
在本文中，我們了解到在電子顯微鏡樣品制備過程中可以保存熒光。我們展示了相關方案并解釋了主要步驟。關鍵步驟是高壓冷凍和使用低濃度UA進行冷凍置換，以形成電子對比，然后嵌入丙烯酸樹脂中。
該工作流程使研究人員能夠在以下過程中使用熒光定位修塊，并可能在切片過程中進行靶向控制。
盡管如此，僅靠熒光引導對剛興趣區域，進行高效修塊，就已使研究人員能夠將電子顯微鏡數據，僅集中在目標區域，從而減少電鏡拍攝時間和總體成本。
樹脂內熒光還允許應用于CLEM。這一點尤為有用，因為在為EM制備樣品的過程中，樣品的收縮可能不均勻，導致包埋前的熒光和包埋后的EM數據無法精確關聯。
熒光引導靶向。傳統的視覺線索有助于確定塊面的方向，但無法揭示樹脂中的標記結構。樹脂內熒光解決了這一問題，它通過特定的包埋方案保留熒光信號，從而可以直接修塊到細胞靶標或標記的細胞簇。這種靶向方法減少了不必要的切割，提高了效率，尤其在體電子顯微術和相關研究中。
體視和干涉視圖仍然不可少。體視顯微鏡可提供塊面的必要概覽，而干涉色仍然是快速可靠的厚度測量工具。當與熒光相結合時，這些方法可提供互補信息：體視和干涉可確定方向和厚度，而熒光可精確定位目標本身。
明場輔助對齊。在明視野中，觀察刀具和塊面之間的光隙，可讓操作員在嘗試切割前優化定位。這增加了信心，有助于避免在切割定位目標時，出現代價高昂的錯誤。同時，集成工作流程節省時間。
在顯微鏡和成像系統之間切換會減慢制備速度并增加變異性。UC Enuity將熒光體視顯微鏡和引導式修剪整合到一個程序中，簡化了導航和切割。這樣可以減少設置時間，最大限度地減少用戶誤操作，并確保多個操作員的結果具有可重復性。
CLEM工作流程同樣也能從中受益。熒光和電鏡信號之間的精確關聯對CLEM研究至關重要。通過可視化樹脂中的標記細胞，UC Enuity使研究人員能夠無縫連接數據集，使光電關聯項目更快、更可靠。
漸進式技能培養。新用戶可以從明場和干涉檢查開始，學習切片厚度和對齊的基礎知識。隨著信心的增強，可以引入熒光導航，分階段培養技能。這種分階段發展的方法，可確保實驗室能夠采用熒光工作流程，而不會讓受訓人員感到力不從心。
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