現代病毒學研究變得比以往任何時候都更加重要。病毒學家可以應用許多的技術和檢測方法來研究病毒的結構和功能。理解病毒行為的一個重要且常被忽視的方面是能夠可視化它們對宿主細胞的影響。因此，免疫熒光代表了一種工具，可以用來觀察病毒感染及其對宿主細胞的影響。

病毒學

2020 年初，病毒學領域突然進入公眾視野，原因是 SARS-CoV-2 的爆發，這是一種導致人類新型呼吸疾病的病毒。導致了全球大流行。因此，進行了巨大的努力來治療這種疾病并限制其傳播。

理解這些傳染性病原體的行為對于我們治療病毒性疾病和防止進一步爆發的能力至關重要。病毒學旨在理解病毒的各個方面，包括它們的結構、演化、進入宿主細胞、繁殖、引起的疾病、宿主對感染的反應以及它們在個體之間的傳播。

設計和實施有效治療和預防措施的關鍵方面之一是能夠可視化病毒成分及其對宿主細胞的影響。為了實現這種可視化，免疫熒光顯微鏡是一種有價值的方法。

免疫熒光基礎

免疫熒光[1,2]是一種利用抗體與其抗原的結合特異性來可視化生物系統的結構和動態的方法。抗體是針對特定蛋白質產生的，或者直接用熒光標記標記，或者與熒光標記的二級抗體結合使用，以識別和研究感興趣蛋白質的存在。

這種廣泛使用且多功能的技術使科學家能夠在各種背景下可視化蛋白質、細胞成分和細胞過程。例如，它可以用于研究細胞器的結構、組織中蛋白質的分布，以及在樣本中染色以檢測特定生物標志物的存在。免疫熒光如何在病毒學研究中發揮作用？

免疫熒光在病毒學研究中的應用

病毒是納米級的病原體，大多數小于 0.4 微米；需要電子顯微鏡來觀察它們的納米結構。然而，標準和超分辨率顯微鏡技術是易于獲取的工具，可以用于理解病毒的更大規模結構和功能。

免疫熒光與多種成像方法兼容，包括標準寬場成像、共聚焦顯微鏡、壽命成像和超分辨率顯微鏡[3-4]。選擇使用哪種方法主要取決于具體應用。

診斷

使用寬場顯微鏡進行標準免疫熒光染色已被廣泛用于通過患者的鼻咽拭子診斷流感等病毒感染。使用針對病毒特異性蛋白的抗體對感興趣的組織進行染色，臨床醫生可以快速確定樣本中是否存在病毒。該程序缺乏更先進的分子方法的靈敏度；然而，它快速、簡單且具有臨床價值[5,6]。

感染機制

病毒的一個關鍵特征是它們必須進入宿主細胞才能繁殖并引起疾病。一旦它們附著在宿主細胞上，就會釋放其遺傳物質進入細胞。遺傳物質被細胞識別并表達。編碼的成分隨后以多個副本的形式存在，這些副本能夠組裝成新的病毒顆粒。這些新顆粒由細胞釋放，并可以繼續感染新的宿主。因此，病毒劫持宿主細胞的機制以促進其致病效應。

理解這一復雜且高度可變的過程對于理解病毒的感染機制至關重要，尤其是像 SARS-Cov-2 這樣的近期病毒。例如，免疫熒光檢測已被用于研究 SARS-Cov-2 與細胞表面受體的結合動態[7]，以及研究其細胞內動態，包括病毒顆粒如何在細胞內組裝[8]。

對細胞功能的影響

除了檢測病毒入侵的存在和揭示其動態外，理解感染的發病機制也至關重要。免疫熒光技術是這些研究的重要工具，因為能夠可視化細胞反應對于理解病毒疾病至關重要。這類研究可能包括細胞應對病毒感染的壓力反應動態[9]，以及病毒如何影響細胞和組織修復[10]。例如，一項研究表明，狂犬病毒感染細胞可以促進細胞質應激顆粒的形成，這些無膜動態結構由 mRNA 和蛋白質聚集體組成，能夠迅速在細胞應激反應中形成[9]。研究人員使用徠卡共聚焦顯微鏡。另一項研究揭示，感染流感病毒（IV）的上皮干/祖細胞的修復在很大程度上依賴于成纖維生長因子受體 2b（Fgfr2b）信號通路[10]。 一些免疫熒光染色細胞的圖像是用 徠卡正置顯微鏡拍攝的（參見圖 1）。

圖 1：Nocodazole（NCZ）對狂犬病毒誘導的應激顆粒（SGs）的影響。感染 U373-MG 細胞后，在病毒接種前和感染過程中使用 NCZ 或二甲基亞砜（DMSO）進行模擬處理。感染后的細胞用山羊抗 TIA-1、小鼠抗α微管蛋白和兔抗 P 抗體共同染色，然后用 Alexa-488 驢抗羊 IgG、Alexa-568 驢抗鼠 IgG 和 Alexa-647 驢抗兔 IgG 混合物孵育。圖像由 Leica 共聚焦顯微鏡拍攝。比例尺為 15 μm。圖片改編自參考文獻 10（Nikolic 等，PLoS Pathog.）

治療

最后，為了設計和提供安全有效的治療和預防疫苗，我們必須觀察宿主細胞及其與病毒的相互作用如何受到治療的影響。免疫熒光可以用于測試在細胞內的定位和行為[11]，抗體雞尾酒的結合特性[12]，以及治療對細胞內病毒顆粒的存在和定位的影響。

結論

雖然分子研究是病毒學領域的重要工具，但顯微鏡為研究和臨床應用提供了見解，幫助完整展示功能與結構之間的關系。免疫熒光檢測通常是快速而簡單的程序，使研究人員能夠可視化病毒感染的影響和動態。在經歷大流行后的當前全球氣候中，這些方法代表了預防和治療這些病原體的關鍵工具。

參考文獻：

1. W. Ockenga, An Introduction to Fluorescence, Science Lab (2011) Leica Microsystems.

2. C. Greb, Fluorescent Dyes, Science Lab (2012) Leica Microsystems.

3. W. Ockenga, Fluorescence in Microscopy, Science Lab (2011) Leica Microsystems.

4. F. Hoff, How to Prepare Your Specimen for Immunofluorescence Microscopy, Science Lab (2015) Leica Microsystems.

5. S.V. Vemula, J. Zhao, J. Liu, X. Wang, S. Biswas, I. Hewlett, Current approaches for diagnosis of influenza virus infections in humans, Viruses (2016) vol. 8, iss. 4, p. 96, DOI: 10.3390/v8040096.

6. C.R. Madeley, J.S.M. Peiris, Methods in virus diagnosis: Immunofluorescence revisited, J. Clin. Virol. (2002) vol. 25, iss. 2, pp. 121–134, DOI: 10.1016/S1386-6532(02)00039-2.

7. W. Tai, L. He, X. Zhang, J. Pu, D. Voronin, S. Jiang, Y. Zhou, L. Du, Characterization of the receptor-binding domain (RBD) of 2019 novel coronavirus: implication for development of RBD protein as a viral attachment inhibitor and vaccine, Cell. Mol. Immunol. (2020) vol. 17, iss. 6, pp. 613–620, DOI: 10.1016/S1386-6532(02)00039-2.

8. H. Zhang, J. Tu, C. Cao, T. Yang, L. Gao, Proteasome activator PA28γ-dependent degradation of coronavirus disease  nucleocapsid protein, Biochem. Biophys. Res. Commun. (2020) vol. 529, iss. 2, pp. 251–256, DOI: 10.1016/j.bbrc.2020.06.058.

9.  J. Nikolic, A. Civas, Z. Lama, C. Lagaudrière-Gesbert, D. Blondel, Rabies Virus Infection Induces the Formation of Stress Granules Closely Connected to the Viral Factories. PLoS Pathog. (2016) vol. 12, iss. 10, e1005942, DOI: 10.1371/journal.ppat.1005942.

10. J. Quantius, C. Schmoldt, A.I. Vazquez-Armendariz, C. Becker, E. El Agha, J. Wilhelm, R.E. Morty, I. Vadász, K. Mayer, S. Gattenloehner, L. Fink, M. Matrosovich, X. Li, W. Seeger, J. Lohmeyer, S. Bellusci, S. Herold, Influenza Virus Infects Epithelial Stem/Progenitor Cells of the Distal Lung: Impact on Fgfr2b-Driven Epithelial Repair, PLoS Pathog. (2016) vol. 12, iss. 6, e1005544, DOI: 10.1371/journal.ppat.1005544.

11. C. Wei, C. Zheng, J. Sun, D. Luo, Y. Tang, Y. Zhang, X. Ke, Y. Liu, Z. Zheng, H. Wang, Viperin inhibits enterovirus A71 replication by interacting with viral 2C protein, Viruses (2019) vol. 11, iss. 1, p. 13, DOI: 10.3390/v11010013.

12. E. Davidson, C. Bryan, R.H. Fong, T. Barnes, J.M. Pfaff, M. Mabila, J.B. Rucker, B.J. Doranz, Mechanism of Binding to Ebola Virus Glycoprotein by the ZMapp, ZMAb, and MB-003 Cocktail Antibodies, J. Virol. (2015) vol. 89, iss. 21, pp. 10982–10992, DOI: 10.1128/JVI.01490-15.

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