您是否遇到這些難題？

1. 固定組織（PFA）無法提取高質量RNA？

2. 樣本異質性強，結果不準確、不可靠？

3. 單細胞/空間轉錄組成本高、分辨率受限？

4. 珍貴病理樣本有限，不足夠開展多個實驗？

例如在肝臟等復雜組織研究中提取RNA分析面臨以下挑戰：

組織異質性嚴重：肝臟包含肝細胞、膽管上皮、免疫細胞等，傳統整體提取難以反映真實表達差異

空間信息丟失：單細胞測序需組織解離，破壞細胞原位信息

技術方案受限：空間轉錄組：圖像分辨率或通量受限；傳統 LCM（Laser Capture Microdissection，激光捕獲顯微切割）大多使用新鮮樣本，無法利用大量病理固定組織

病理固定組織RNA難以提取，降解快，缺乏標準化流程

臨床樣本珍貴：無法轉化為高質量和足夠的RNA分析數據。

激光顯微切割，即LMD（Laser Microdissection）技術，精準從組織切片中分離目標單細胞 / 特定組織區域，適配后續核酸提取測序。南方醫科大學汪艷教授團隊發表于Journal of Visualized Experiments的工作中，第一作者曾偉蘭博士作為方法學核心執行人，依托學校科研支持中心（中心實驗室）平臺及該平臺配備的徠卡LMD激光顯微切割系統，成功構建了一套從固定組織到RNA測序的標準化解決方案，實現精準到單細胞級別分選，兼容PFA固定+冰凍切片樣本，5天內完成從取材到測序建庫，1000個細胞即可獲得高質量RNA分析結果的實踐方案。該方案提供了一套完整可重復的標準化實驗流程：樣本制備 → LMD 精準切割 → RNA提取 → qPCR / RNA-seq。

真正實現：固定組織 → 精準分選 → 高通量分子分析

關鍵技術突破

01、固定組織RNA提取優化

控制PFA固定時間24h，避免蛋白-核酸過度交聯不可逆損傷RNA

優化解交聯 + 蛋白酶K消化體系，提高RNA釋放效率

RNase全流程控制，保障RNA穩定性

02、高效LMD取樣策略

快速蘇木素染色替代復雜免疫染色

單張切片30–60min內完成切割，全部切割4h內結束，高效完成目標采集

精準圈選目標細胞群，避免污染

03、微量樣本高質量輸出

1000 cells → \~110 ng RNA

A260/A280：1.9–2.1

文庫片段：300–500 bp（符合測序要求）

該方案從臨床到科研全面釋放樣本價值：

肝病機制研究（MASH、肝損傷、纖維化等）

特定細胞群表達譜分析

微環境與免疫細胞研究

固定病理樣本回顧性研究

為什么選擇徠卡LMD激光顯微切割系統

高精度激光切割，細胞級分辨率

參數可控，適配不同組織類型

可在空間背景下通過可視化控制，實現純凈、無接觸、無污染的樣本采集

具備高通量處理能力，適應下游質譜等分析需求

樣本采集使用標準耗材，通用方便

LMD激光顯微切割系統不僅是一臺激光顯微切割顯微鏡，更是一套完整DVP解決方案，將細胞顯微結構與分子連接，打開病理樣本高價值再利用的可能。

汪艷教授團隊優化的LMD顯微切割步驟：

本流程參考了既往文獻的LMD通用操作規范，并針對固定組織中RNA易降解的特性，進行了優化調整。

1.用去除RNase試劑擦拭實驗臺面與儀器表面。

2.開啟LMD控制器，等待顯微鏡完成初始化。

3.擰動激光器鑰匙至開機檔位，啟動LMD激光系統。激光預熱10分鐘。

4.打開電腦及LMD軟件，等待軟件初始化結束。

5.將0.2mL PCR管裝入收集裝置。

6.在PCR管蓋中加入10μL RNA提取緩沖液（RNeasy FFPE 試劑盒配套試劑）。

7.將收集裝置裝回顯微鏡。

8.在LMD收集設備設置界面，點擊 “移至參考點"，調節相機焦距使參考點成像清晰，必要時通過方向按鍵將參考點調至視野中央，進行收集設備位置校準。

9.組織切片面向下、標簽朝右裝入標本夾。

10.選用10倍物鏡定位樣本區域，進入激光菜單點擊校準，彈窗選擇確認。

11.設置激光參數（供參考）：Power 50、Aperture 5、Speed 9。

12.工具欄圈選目標區域，選擇單一圖形，點擊開始切割；組織粘連無法自動掉落時，可選用手動裁切模式。警示：操作中禁止直視激光束，防止輻射損傷。

13.可通過軟件菜單保存切割前后鏡下畫面。

14.收集足量細胞后卸下收集組件，再次向管蓋補加提取緩沖液至終體積10μL，密封PCR管。

15.充分渦旋混勻收集管。

16.短暫離心，樣品- 80℃保存待用。后續樣本重復5～16步，切割結束可暫停實驗，待統一提取RNA。

注意：單張玻片樣品顯微切割用時控制在30分鐘～1小時，全部切割操作建議4小時內完成。

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